2023年第1期封面文章穆晓红：携载川芎嗪缓释微粒导电水凝胶修复脊髓损伤实验研究
2023年第1期封面文章穆晓红：携载川芎嗪缓释微粒导电水凝胶修复脊髓损伤实验研究
TGTP水凝胶能改善脊髓损伤大鼠的神经功能，抑制炎症反应，减轻脊髓组织架构破坏。
2023年1期封面文章为《携载川芎嗪缓释微粒导电水凝胶修复脊髓损伤实验研究》。川芎嗪是一种具有扩张血管、抑制炎症反应、调控神经细胞凋亡等多种功效的药物，也能促进脊髓损伤后神经功能修复。然而，传统制剂存在体内半衰期短、局部利用率低、需多次大剂量给药等局限性，临床应用受限。本研究以导电性水凝胶作为载体，构建携载川芎嗪缓释微粒导电水凝胶，并通过大鼠脊髓完全横断模型修复实验，明确该水凝胶能有效促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复，其机制可能与调节炎症反应有关。封面设计灵感来自于脊髓横截面的独特形状，将损伤脊髓比作“翅膀缺失的蝴蝶”携载川芎嗪缓释微粒导电水凝胶环绕其周围渗透，最终蝴蝶翅膀完美修复，再次振翅高飞，体现了水凝胶修复脊髓损伤作用。
穆晓红，教授/主任医师，博士生导师，博士后合作导师，教育部“新世纪优秀人才”，师从俄罗斯工程院外籍院士、“东方脑瘫外科之父”徐林教授。现任北京中医药大学骨伤临床学系副主任，北京中医药大学东直门医院骨伤四科主任，中国康复医学会骨与关节康复专业委员会秘书长、青年工作委员会主任委员。现主持国家自然科学基金2项，省部级课题5项，发表论文100余篇，主编（副主编）教材5部，荣获中国康复医学会科学技术一等奖2项，2022年被中国康复医学会评选为“最美康复科技工作人员”。擅长中西医结合治疗脊柱脊髓疾病、脑性瘫痪的外科治疗与康复。
蒋昇源，北京中医药大学在读博士研究生，师从穆晓红教授，主要是做中医药联合组织工程材料修复脊髓损伤的临床与基础研究，在SCI及国内核心期刊发表各类学术论文20余篇。
蒋昇源1，邓博文1，刘港1，范筱1, 2，白惠中1，赵毅1，徐林1，穆晓红1
探讨携载川芎嗪缓释微粒导电水凝胶（以下简称“TGTP水凝胶”）对脊髓损伤大鼠的神经保护作用。
将48只成年雌性SD大鼠随机分为4组，假手术组（A 组）、模型组（B组）、导电水凝胶组（C组）、TGTP水凝胶组（D组），每组12只。A组仅行椎板切除术，B～D组均制备脊髓完全横断大鼠模型。分别于造模前及造模后1、3、7、14、28 d采用BBB评分评估各组大鼠后肢运动功能恢复情况。造模后28 d处死动物取材行劳克坚牢蓝（luxol fast blue，LFB）染色检测髓鞘再生情况；Nissl染色检测神经元存活情况；免疫组织化学染色评估炎症相关因子（NF-кB、TNF-α、IL-10）表达情况；免疫荧光染色和Western blot评估神经丝蛋白200（neurofilament 200，NF200）表达。
造模后各时间点A组BBB评分均优于其余3组（P0.05）；14、28 d C、D组BBB评分差异无统计学意义（P0.05），但D组BBB评分明显优于B组（P0.05）。LFB染色与Nissl 染色示，A 组神经元及髓鞘结构完整，D组髓鞘完整性与神经元存活数量均明显优于B、C组。免疫组织化学染色示， A组NF-κB、TNF-α吸光度（A）值明显低于B、C组（P0.05），IL-10 A 值明显高于其余3组（P0.05）；D组NF-κB A值明显低于B、C组，TNF-α A值明显低于B组，IL-10 A值明显高于B组，差异均有统计学意义（P0.05）。免疫荧光染色示，A 组神经元及神经纤维结构清晰，荧光强度高；D组较B、C组NF200荧光强度高，可见部分神经纤维。Western blot检测示A 组NF200蛋白相对表达量最高，D组NF200蛋白相对表达量明显高于B、C组（P0.05）。
TGTP水凝胶能有效促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复，其机制可能与调节炎症反应有关。
脊髓损伤是一类致残性极强的疾病，目前临床常用的激素冲击疗法效果有限，探寻新的治疗方法已成为研究关注焦点[1]。中枢神经系统组织自我修复能力比较差，脊髓损伤后病灶局部聚集大量胶质细胞和炎症细胞，分泌抑制神经元、轴突和髓鞘再生的相关因子，进而形成抑制神经组织生长的微环境，限制了脊髓损伤后神经功能修复[2-3]。
川芎嗪具有扩张血管、抑制炎症反应、调控神经细胞凋亡等多种功效[4]，相关研究已证实其可以在一定程度上促进脊髓损伤后神经功能修复[5-6]。然而，传统制剂存在体内半衰期短、局部利用率低、需多次大剂量给药等局限性，临床应用受限[7]。因此，探索并制备一种安全有效的组织工程材料作为川芎嗪的载体，实现其在损伤局部靶向缓释，对于脊髓损伤修复具备极其重大意义。
近年来，源自细胞外基质的导电性水凝胶逐步应用于脊髓损伤的治疗，水凝胶特有的三维网状结构有利于轴突、微血管等组织再生[8-9]。水凝胶在损伤局部不仅能起到“桥梁”连接作用，还能作为 “载体”携载多种有利于修复的要素[10]。同时，导电材料的加入可使神经细胞膜电位发生改变，由此产生生物电现象，有助于神经的发育、成熟和再生[11]。研究证明，经单宁酸改性的导电聚吡咯水凝胶兼具生物相容性、可降解性、导电性等优势，可作为川芎嗪缓释的良好载体[12]。本研究通过建立大鼠脊髓完全横断模型，于损伤局部植入携载川芎嗪缓释微粒导电水凝胶（以下简称“TGTP 水凝胶”），探讨其修复脊髓损伤的作用与机制。
雌性8 周龄SD大鼠48只，体质量220～240 g，由中国中医科学院骨伤研究所提供。造模前，大鼠统一于标准动物实验环境（温度22℃，湿度40%～50%，12 h 光/暗循环）下适应性喂养1 周，4 只/笼，不限制饮食、活动。
甲基丙烯酰化明胶、光引发剂（Irgacure2959）、导电聚吡咯由华南理工大学提供；PBS 溶液（Sigma公司，美国）；DAPI封固剂、TNF-α抗体、抗鼠/兔通用型免疫组织化学检测试剂盒（Abcam公司，英国）；Nissl染色液（北京索莱宝科技有限公司）；神经丝蛋白200（neurofilament 200， NF200）抗体、NF-κB、IL-10 抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；盐酸川芎嗪注射液（哈尔滨三联药业股份有限公司）；戊巴比妥钠（北京普博斯生物科技有限公司）；注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司）。UV点光源固化机（珠海皓云光电科技有限公司）；倒置相差显微镜、RM2315石蜡切片机、激光扫描共聚焦显微镜（Leica公司，德国）；扫描电镜（FEI公司，德国）。
1.2.1 TGTP水凝胶的制备配置500 μg/mL盐酸川芎嗪溶液，于避光条件下将0.01 g光引发剂（Irgacure2959）溶于1 mL川芎嗪溶液，60℃水浴加热5～10 min，待颗粒完全溶解后，添加0.1 g 甲基丙烯酰化明胶和0.03 g 导电聚吡咯及适量单宁酸。超声波振荡器充分混匀后，置于60℃水浴加热10 min。使用移液枪吸取10 μL混合液于自制模具中，暗室内紫外线 s 即可成胶。TGTP水凝胶制作完成后，将其浸泡于75%乙醇溶液中12 h，每隔3 h 更换1次乙醇，4℃保存。使用 前置于PBS溶液冲洗3次。
① 扫描电镜观察：实验前冷冻干燥水凝胶样品，将冻干样品置于液氮中20 s进行淬断，断面朝上黏附于样品台上，喷金60 s增强水凝胶样品的导电性能，在加速电压10.0 kV条件下观察其微观形貌。
② 药物体外缓释实验：根据川芎嗪的吸收光谱确定最大吸收波长，随后使用川芎嗪标准溶液制作工作曲线，明确药物含量与吸光度（A）值的线 g TGTP水凝胶置于50 mL、pH7.4 的PBS溶液中孵育，37℃下轻轻摇动孵育系统。每隔24 h 收集上清液，共收集14 d上清液，根据上清液在川芎嗪最大吸收波长处的A值确定上清液中川芎嗪含量，从而计算药物释放率。
采用随机数字表法将48只大鼠分为4 组：假手术组（A组）、模型组（B组）、导电水凝胶组（C组）、TGTP水凝胶组（D 组），每组12 只。
术前所有大鼠禁饮食12 h，经腹腔注射0.3%戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉后，备皮消毒，俯卧位固定于操作台上。以T9、T10骨性标志点为中心，使用15 号尖刀片沿棘突纵形切开皮肤、筋膜，剥离并用撑开器撑开两侧椎旁肌，咬骨钳咬除T9、T10 棘突，暴露椎板骨面及关节突关节内侧缘，深入椎板间隙咬除T9、T10椎板，暴露脊髓。A组仅行T10 椎板切除；其余3组使用自制显微双刃剪离断脊髓，离断长度2 mm，C、D组分别于损伤部位植入导电水凝胶和TGTP水凝胶。生理盐水冲洗切口，依次缝合各层组织。术后每天20 万U青霉素皮下注射，连续3 d。大鼠4 只/笼饲养，室温保持22℃，术后每日早、中、晚3 次按摩膀胱排尿，术后1周 改为早、晚各1 次。
造模前及造模后1、3、7、14、28 d每组随机选取6只大鼠，采用BBB评分法评估大鼠 后肢运动功能恢复情况。
造模后28 d每组分别取6只大鼠，0.3%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，行多聚甲醛心脏灌注，待大鼠全身僵硬后，以脊髓损伤处为中心，取约1.5 cm长脊髓组织，标注头尾端。固定于4%多聚甲醛溶液中，经脱水、石蜡包埋后，制成5 μm厚石蜡切片。切片脱蜡至水，于0.5%甲苯胺蓝水溶液56℃温箱中浸染40 min，95%乙醇溶液镜下控制分色，封片后于光镜下观察。
取上述部分切片脱蜡至水，65℃条件下固蓝染液中浸染过夜，水洗分色，无水乙醇快速浸染1次，伊红染液浸染2 min，水洗后镜下观察灰白质清晰，依次经梯度乙醇、二甲苯浸泡，封片后于光镜下观察。
取上述部分切片， PBS 冲洗3次，每次5 min；抗原修复液修复15 min，冷却至室温；3%双氧水阻断室温孵育30 min， PBS 冲洗2次，每次5 min；3%牛血清白蛋白室温孵育30 min。分别滴加NF-кB（1∶100）、TNF-α （1∶200）、IL-10（1∶50）一抗，4℃过夜；滴加适当比例稀释的二抗，37℃孵育30 min；PBS水洗后DAB 显色3 min，苏木素染色5 min，盐酸乙醇分化、返蓝后，透明封片，光镜下观察。采用Image J软 件对结果进行定量分析，分别计算各组平均A值。
造模后28 d 每组分别取3只大鼠，0.3% 戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，行多聚甲醛心脏灌注，取材。次日从4%多聚甲醛溶液中取出部分组织，15%、30% 蔗糖梯度脱水过夜后，OCT包埋，制作冰冻切片，片厚15 μm。3%Triton X-100 溶液透膜10 min，PBS 洗涤3次， 1%牛血清白蛋白封闭；弃血清，滴加鼠源NF200单抗（1∶400）一抗，4℃孵育过夜。滴加相应二抗Alexa Fluor®山羊抗小鼠IgG抗体（1∶400），室温孵育1 h，PBS 洗涤3次，DAPI染核，封片后于激光共聚焦显微镜下观察。
造模后28 d 每组各取3只大鼠，0.3% 戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，于冰面迅速取出损伤部位脊髓，长约1 cm，−80℃冰箱储存备用。脊髓组织研磨后加入适量RAPI裂解液裂解，提取组织总蛋白上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。每组取等量蛋白上样，电泳转膜后， 5%脱脂奶粉室温封闭1 h。一抗4℃孵育过夜， PBS 漂洗后二抗室温孵育1 h，ECL发光法行胶片曝光，利用Photoshop图像处理软件进行灰度值测定，以NF200 蛋白与GAPDH比值作为其相对表达量。
采用SPSS25.0 统计软件做多元化的分析。计量资料行正态性检验，NF-кB A值和NF200蛋白表达量符合正态分布，以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验；TNF-α和IL-10 A值不符合正态分布，以M（ Q1，Q3）表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验；各组不同时间点BBB评分比较采用重复测量方差分析，若不满足球形检验，采用Greenhouse-Geisser法进行校正，同一组别不同时间点比较采用 Bonferroni 法，同一时间点不同组别间比较采用多因素方差分析。检验水准α=0.05。
新合成的TGTP水凝胶能够牢固附着于瓶底，提示该凝胶已从溶胶状态转变为凝胶状态。扫描电镜观察示，TGTP水凝胶内部出现明显孔隙样结构，为神经轴突及微血管的长入提供了保障。TGTP水凝胶拥有非常良好的药物缓释功能，第14天释放率 可达80%左右。见图1。
a. 紫外光源照射下合成TGTP水凝胶；b. 扫描电镜观察（×200）；c. TGTP水凝胶体外缓释川芎嗪微粒检测
造模前各组大鼠BBB 评分均为21 分。造模后各时间点，A组大鼠BBB评分均高于其余3 组，差异有统计学意义（P0.05）；造模后1、3、7 d，B、 C、D组BBB 评分差异均无统计学意义（P0.05）；14、28 d C、D 组BBB评分差异无统计学意义（P0.05），但D 组BBB评分明显高于B组，差异有统计学意义（P0.05）。见表1、图2。
A组脊髓结构完整，灰质、白质界限清晰，灰质内大量神经元存在，尼氏体呈虎斑状，形态规则；B组脊髓缺损周围组织溶解，几乎无神经元存在；C组灰质内仅可见少量残留神经元，尼氏体形态欠完整；D组神经元数量较B 组多，可见到部分 未凋亡的神经元。见图3。
A组脊髓组织髓鞘为亮蓝色，白质连续完整，排列致密有序；B组出现神经纤维缺损，损伤周边组织出现溶解性空洞；C、D组白质内髓鞘完整性有所改善，D 组空洞面积减小，组织连续性好，髓鞘结构相对完整、致密。见图4。
镜下见NF-кB、TNF-α、IL-10 弥散性散在分布于损伤周围组织，阳性表达呈棕褐色。A、D 组NF-кB A值明显低于B、C组，A组低于D组，差异均有统计学意义（P0.05）。A组TNF-α A值明显低于B、C组，D组低于B组，差异有统计学意义（P0.05）；其余各组间TNF-α A值比较差异均无统计学意义（P0.05）。A组IL-10 A值明显高于其余3组，C、D组高于B 组，差异均有统计学意义（P0.05）；其余各组间IL-10 A值比较差异均无统 计学意义（P0.05）。见图5 及表2。
图 5 造模后28 d各组脊髓组织各炎症因子免疫组织化学染色观察（×20）
A组神经纤维结构完整，连续性好，灰质内可见形态规整神经元；B组神经纤维呈点状存在，未见完整神经元；C组神经纤维数量较B组多，D组神经纤维与神经元数量显著多于B、C组，但与A组相比，神经元形态仍欠规则、核固缩。见图6。
图 6 造模后28 d各组NF200免疫荧光染色观察（激光共聚焦显微镜×20）
A、B、C、D组脊髓组织中NF200 蛋白相对表达量分别为1.44±0.01、0.76±0.03、0.95±0.02、 1.23±0.02。A组脊髓组织中NF200 蛋白相对表达量明显高于其余3组，差异有统计学意义（P 0.05）；C、D组高于B 组，D 组高于C组，差异均 有统计学意义（P0.05）。见图7。
脊髓损伤后炎症反应、胶质瘢痕形成等一系列继发性级联反应限制了神经再生与修复[13]。在传统手术与药物等治疗方法效果欠佳的情况下，组织工程材料携载药物、细胞或生长因子成为修复脊髓损伤的新手段[14]。水凝胶由于软组织力学特性可控，不仅仅可以填补脊髓原发性缺损，还能使携载的药物形成局部富集与缓释[15-16]。导电水凝胶的应用能加强细胞间生物电信号交流，恢复因损伤中断的传导性神经通路，维持神经再生所需的电学微环境[17]。基于上述背景，本研究首先在体外合成TGTP 水凝胶，扫描电镜及体外药物缓释实验提示其拥有非常良好组织生长空间，盐酸川芎嗪微粒也能够逐步缓释，优良的组织工程材料学特性为后续体内实验研究奠定了基础。
当前，组织工程材料修复脊髓损伤的基础研究多选择脊髓半切或全切大鼠模型，考虑到脊髓半切没办法做到定量切除脊髓组织、实验一致性没办法实现的劣势，本团队自主研发了显微双刃剪，该器材可实现定量、精准切除脊髓组织[18]。导电水凝胶虽然能够填补原发性创伤所致空腔，但其自身在诱导神经细胞再生方面疗效有限；干细胞移植虽能有效补充坏死、凋亡的神经细胞，但受限于其自身无法模拟脊髓局部复杂的微环境，存活率大幅度的降低[19]。中医药治疗脊髓损伤具有“多途径、多靶点”的优势，可特异性地针对脊髓损伤病理机制的复杂特点[20]。因此，本研究将具备改善微循环、保护神经细胞作用的盐酸川芎嗪微粒添加至导电水凝胶中，制备TGTP水凝胶并植入大鼠脊髓缺损处，以期通过缓释川芎嗪微粒，使药物直接通过血脑屏障在体内长久起效，提高药物体内利用率，避免体外长期给药、药物半衰期短的缺点。
BBB 评分是公认的评估脊髓损伤大鼠后肢运动功能的方法[21]。本研究通过评估造模后不同时间点4组大鼠BBB 评分，发现D组自造模后14 d起， BBB评分即优于B 组。虽然D组改善脊髓损伤大鼠后肢运动疗效明显，但仍未观察到大鼠后足掌面着地的现象，分析原因可能在于脊髓全横断模型创伤过大，短时间内神经功能恢复受限。另外，本研究还采用Nissl染色与LFB 染色分别评估了各组大鼠脊髓组织神经元存活、髓鞘再生等情况，结果显示D组脊髓缺损处周围仍可见少量残存神经元，且组织溶解率降低，神经纤维排列也相对有序，髓鞘密集，这进一步说明了TGTP水凝胶能够发挥保护神经细胞、抑制脱髓鞘的作用，最大限度地保护轴突，协助生物电信号跳跃式传递，维持并保护神经元的正常功能。脊髓修复过程中轴突再生至关重要[22]，NF200 作为构成神经元的基本骨架结构之一，主要存在于轴突中[23]。我们分别通过免疫荧光染色和Western blot检测了各组NF200 的表达，结果显示D组NF200表达量明显高于B、C组，说明TGTP水凝胶可以在一定程度上促进神经元结构的修复，并生成轴突做正常生理活动，某些特定的程度促进了脊髓损伤神经功能修复。该结果也对前述行为学、组织形态学染色结果做出了解释，如果缺少神经元及神经轴突的存在，势必没办法完成运动功能的恢复。
在明确TGTP水凝胶疗效的基础上，本研究初步探索了其修复脊髓损伤的机制。脊髓原发性损伤后，包括中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞向损伤区域浸润，并激活常驻小胶质细胞，释放大量炎症因子，促炎与抗炎因子稳态被破坏，进一步诱导神经元坏死、凋亡[24-25]。NF-кB广泛存在于真核细胞胞质内，该通路可调控多种参与炎症反应的细胞因子，如TNF-α、IL-10 等，影响细胞增殖、分化及凋亡[26-27]。维持脊髓组织内促炎/抗炎因子的平衡，对于促进脊髓损伤恢复具备极其重大意义。本研究通过免疫组织化学染色检验测试发现，脊髓损伤后B 组NF-кB、TNF-α表达量明显增多，IL-10表达量极低，而D 组能够大大降低 NF-кB、TNF-α的表达，促进IL-10表达。因此，本研究暂且能得出结论， TGTP水凝胶能减轻脊髓损伤后炎症反应，抑制NF-кB 信号通路及促炎因子分泌，促进抗炎因子表达，维持脊髓损伤微环境稳态，保护神经细胞。
综上述，TGTP水凝胶能改善脊髓损伤大鼠的神经功能，抑制炎症反应，减轻脊髓组织架构破坏。但由于本研究仅为体外及动物实验，存在一定局限性，关于TGTP水凝胶是不是真的存在细胞毒性作用，以及修复脊髓损伤的具体分子机制尚待进一步研究。
《中国修复重建外科杂志》是由中华人民共和国国家卫生健康委员会主管，中国康复医学会、四川大学主办的国家级医学专业学术期刊。于1987年创刊，月刊，每月15日出版。期刊以“修复缺损、重建功能、改善外形，促进结构、功能、形态的完美结合”为办刊宗旨；学科领域覆盖骨科、手外科、显微外科、整形外科、口腔颌面外科、泌尿外科、神经外科、康复医学、再生医学等。期刊自1997年持续被国际权威医学数据库MEDLINE收录，2021年被美国国立医学图书馆PubMed Central (PMC)全文数据库收录，也是国内三大核心期刊数据库（中文核心期刊要目总览、中国科学引文数据库、中国科技核心期刊）来源期刊，是目前能够综合反映我国修复重建外科领域最高发展水平的学术期刊。期刊于2011年、2014年、2017年和2020年连续入选第2届、第3届、第4届以及第5届中国精品科技期刊。